Recherche de l’ARN du virus SARS-CoV2 par PCR

Depuis le début de la pandémie Covid-19 due au virus SARS-CoV2, de nombreux tests sont réalisés. L’un deux est le test de la PCR. Laurena, professeur de SVT explique l’utilisation de ce type de test permettant de détecter une trace d’ARN dans le prélèvement naso-pharyngé d’un patient.

Téléchargez le support du cours en PDF.

► Ce cours s’adresse en priorité aux élèves de terminale STL (sciences et technologies de laboratoire) spécialité biotechnologies, mais également aux élèves de première générale qui ont choisi la spécialité SVT.

Qu’est-ce que la PCR, l’ADN et l’ARN ?

Tout d’abord, chez tous les êtres vivants, il existe deux types de molécules assurant le support de l’information génétique :

• L’ADN (Acide Désoxyribo Nucléique) : elle compose nos chromosomes.
  Elle est une biomolécule composée de deux brins DésoxyriboNucléique qui s’apparie selon une règle stricte : les cytosines s’apparient avec les guanines et les adénines s’apparient avec les thymines.
• L’ARN (Acide RiboNucléique) : elle est composée d’un seul brin de RiboNucléique de cytosine, guanine, adénine et uracile.

Chez les virus, l’information génétique est portée soit par une molécule d’ADN (exemple : herpès virus), soit par l’ARN (exemple : SARS-Cov 2, dit coronavirus). Pour ce dernier cas, le test PCR (Polymerase Chain Reaction) permet de déterminer la présence ou non de cet ARN dans les prélèvements des patients et de quantifier le nombre de génome reflétant ainsi la charge virale. Pour cela, la PCR, va répliquer, dans un échantillon peu abondant, d’importantes quantités d’ADN spécifique et ciblée.  

Quels sont les acteurs de la PCR ?

Tous les acteurs de la PCR sont introduits dans le même tube. Il s’agit :

• De l’ADN à amplifier
• Des amorces : il faut utiliser deux types d’amorces. L’une pour l’extrémité 5’ du gêne, et une amorce complémentaire de l’extrémité 3’.
• De l’ADN polymérase

Quelles sont les étapes de la PCR qualitative ?

La technique PCR se compose en trois grandes étapes :

Étape 1 : prélèvement de secrétions chez le patient par voies respiratoires.

Étape 2 : extraction et purification des molécules d’ARN présentes dans les échantillons. Cette étape implique un certain nombre de manipulations. Et les sécrétions des voies respiratoires doivent être manipulées sous des postes de sécurité.

Étape 3 : analyse des échantillons pour voir s’ils contiennent des ARN correspondant au génome du virus par la technique du RT-qPCR.

Ensuite, pour pouvoir détecter l’ARN du SARS-CoV2, on va chercher à détecter des séquences de gènes présents dans le génome du virus. Pour cela, il faut les amplifier afin d’avoir un signal suffisant à leur détection et à leur quantification. Avec la technique PCR, on sait amplifier une molécule d’ADN, mais pas d’une molécule d’ARN. Alors, on va donc convertir, avec la PCR, les ARN extraits en molécule d’ADN grâce à une enzyme : la Transcription inverse. Puis, on cherche à amplifier les séquences spécifiques aux gènes du virus par la PCR.

La PCR (réplication) va se dérouler alors en trois étapes :

Étape 1 : la dénaturation. Elle est effectuée à 95°c pour dissocier les doubles brins de l’ADN.  

Étape 2 : l’hybridation. Les amorces spécifiques se fixent sur un brin d’ADN, grâce au principe de l’appariement des bases complémentaires. Cette étape est effectuée entre 45°c-60°c.

Étape 3 : la polymérisation ou élongation. Elle a lieu à 72°c. Les amorces hybridées à l’ADN servent de point de départ. La polymérisation se fait par ajout successif de Acide Désoxyribo Nucléique présents dans le mélange.

A la fin de cette étape, la séquence est multipliée par deux. Puis, ce cycle sera répété plusieurs fois pour obtenir une quantité d’ADN suffisamment importante. A ce moment-là, on peut savoir si la séquence recherchée (virus SARS-CoV2) est présente ou non dans l’échantillon.

Quelles sont les étapes de la PCR quantitative ?

Pour quantifier le nombre de molécule d’ADN, on pratique ensuite une PCR quantitative, dit qPCR. Elle permet de visualiser en temps réel la formation des produits de PCR à la fin de chaque cycle de PCR. Autrement dit, elle permet de quantifier la charge virale chez le patient.

Pour cela, on va incorporer un signal fluorescent aux molécules d’ADN en cours de formation. Ainsi, à chaque cycle, la machine de PCR va mesurer le signal fluorescent émis proportionnel à la quantité de molécules d’ADN formées. Plus on aura des molécules d’ADN formées, plus le signal fluorescent sera important.